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      GFP Nanobody Agarose Beads
      • 產品貨號:
        BN20545
      • 中文名稱:
        GFP Nanobody Agarose Beads
      • 品牌:
        Biorigin
      • 貨號

        產品規格

        售價

        備注

      • BN20545-500ul/25T

        500ul/25T

        ¥2800.00

      • BN20545-1ml/50T

        1ml/50T

        ¥5200.00

      產品描述

      產品描述:偶聯 anti-GFP 納米抗體的瓊脂糖珠用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。 

      產品優勢

      ? 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈;

      ? 高親和力:解離常數達 nM-pM 級別;

      ? 高載量:20ul 的 beads 懸液可以結合 2-10ug GFP 蛋白; 

      ? 較短的孵育時間,結合 5-30 min 即可;

      應用范圍  

           可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色質免疫沉淀(ChIP)/RNA 結合蛋白免疫沉淀(RIP)、酶活性測定、質譜分析等;

      特異性  

           可以結合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP、CFP 和 ECFP 等。 

      產品特性 

           存儲緩沖液:PBS(含有 20%乙醇)。 保存條件:可在 4℃保存至少 1 個月,在-20 度或-80℃保存 1 年,避免高速離心,干燥和反復凍融。 

      實驗原理

      image.png

      實驗步驟: 

      收集細胞: 

          每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 的哺乳動物細胞(約一個 10 厘米培養皿)表達綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長培養 基、向培養皿中加入 2 毫升預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次,利用細胞刮或胰酶消化的方法收集貼壁細胞,細胞轉移到離心管, 500 g 離心 3-5 分鐘并丟棄上清液。 

      細胞裂解:

           1.用 500 ul 預冷的裂解緩沖液重懸細胞,在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑(自備)。對于膜蛋白或核/染色質蛋白, 可使用 RIPA 裂解液(貨號:BN25012)中加入蛋白酶抑制劑(貨號:BN25002)。 

           2.把離心管放置在冰上 30 分鐘,可以每 10 分鐘充分吹打一次。

           3.細胞裂解產物在 4℃,20,000 g 條件下離心 15 分鐘,轉移裂解產物到一個新的預冷管中,丟棄沉淀。注意:此時細胞 裂解產物可以放在-80℃進行長期儲存。 平衡珠子:

           4.振蕩混勻 GFP-Nanobody-Agarose Beads,吸取 20ul beads 懸液到 500 ul 預冷的裂解緩沖液中,在 4 ℃,2,500 g 條 件下離心 3 分鐘,丟棄上清液。(此步驟可選) 

      結合蛋白

           5. 將細胞裂解產物加入到平衡的 GFP-Nanobody-Agarose Beads 中(如果未做第 4 步,可在細胞裂解產物中直接加入 20ul beads 懸液),在 4 ℃冷柜中的旋轉混合儀上結合5-30 min。根據實驗需要可延長結合時間以達到更好的結合效果。如果 需要,保存 50 ul 的裂解產物進行免疫印跡分析。 

           6. 在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘,丟棄上清液。

      清洗珠子:

           7. 用 500 ul 預冷的裂解緩沖液中洗滌 GFP-Nanobody-Agarose Beads,在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘,丟棄上清液并重復洗滌 2 次。(可選:在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM)。

      洗脫蛋白: 

      方法一: 

           8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重懸 GFP-Nanobody-Agarose Beads。在 95℃條件下加熱 10 min,把免疫沉淀復合物從珠子上游離出來,然后在 4 ℃,2,500 g 條件下離心 3 分鐘收集上清,進行免疫印跡分析。 

      方法二: 

           9. 替代步驟 8 的可選步驟:加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脫結合的蛋白,建議孵育時間 30 秒,并不斷混勻,隨后離心,轉移上清液到新管中,為了中和酸性的甘氨酸,需添加 5ul 1.0 M Tris(pH10.4)。注意:為了提高洗脫效率可以重復這一步。 

      產品效果:

      image.png

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